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本制品是一种基于葡萄糖氧化酶(GOD)和过氧化物酶(POD)的催化反应，通过检测吸光度，快速、高灵敏地对血清、血浆、尿液等生物体液、组织、细胞以及组织或细胞培养上清、饮料等样品中葡萄糖含量进行高灵敏度检测的试剂盒。

本试剂盒的检测原理请参考图1。葡萄糖在葡萄糖氧化酶(GOD)的催化作用下和氧气发生反应，生成D-葡萄糖酸和H2O2。生成的H2O2在过氧化物酶(POD)的作用下与苯酚和4-氨基安替比林生成红色的醌亚胺，再通过检测红色醌亚胺在510nm的吸光度来最终计算样品中葡萄糖的含量。吸光度与样品中葡萄糖的含量成正比。

• 本试剂盒检测灵敏度高，线性范围宽，样品用量少：相较于葡萄糖检测试剂盒(O-toluidine法)，本试剂盒的检测灵敏度更高，检测方法更为灵活。本试剂盒在样品体积为40μL时，可以检测浓度低至0.01mg/mL的葡萄糖，在0.01～0.4mg/mL (即0.056～2.22mM)浓度范围内有良好的线性关系。本试剂盒提供了葡萄糖标准溶液，可以通过绘制标准曲线(图2)，计算出样品中的葡萄糖含量。如果样品的用量较少或者含量较低，推荐使用检测灵敏度更高的葡萄糖检测试剂盒(Amplex Red法)。
  
  
  图2.本试剂盒检测葡萄糖标准品的标准曲线。40μL不同浓度的葡萄糖标准品，与160μL Glucose检测工作液混匀后，40℃避光反应10分钟，测定A510。在0.01～0.4mg/mL (0.056～2.22mM)浓度范围内有良好的线性关系。实际检测数据会因实验条件、检测仪器等的不同而存在差异，图中数据仅供参考。
  
• 提供的检测裂解液有一定的通用性：使用本试剂盒中的BalbLysis Buffer A for Metabolic Assay裂解获得的细胞或组织样品，也可以用于百奥莱博的其它代谢类试剂盒中同样使用BalbLysis Buffer A for Metabolic Assay进行裂解的样品检测，通用性强；而且还可用于检测蛋白浓度、进行SDS-PAGE或一些较易溶解蛋白的Western检测。
  
• 应用范围广：本试剂盒可用于小鼠、大鼠、人等的血清、血浆、尿液等生物体液，细胞培养上清、组织、细胞或饮料样品等的检测，全程约20分钟即可完成。本试剂盒不仅适合少量样品的检测，也非常适合高通量筛选的自动化操作系统。

• 新配制的Glucose检测工作液为浅黄色或浅粉色，长期放置，试剂颜色可能会加深变成深粉色，此时应该弃用，否则可能会对检测产生干扰，因此建议尽量现配现用。
  
• 检测样品中若含有还原性物质如维生素C、谷胱甘肽和尿酸等会竞争消耗葡萄糖氧化生成的过氧化氢，使测定结果偏低。此时推荐使用不受还原性物质影响的葡萄糖检测试剂盒(O-toluidine法)。
  
• 与国内外同类产品相比，本试剂盒可设置背景对照，避免样品中可能的H2O2对结果的干扰。
  
• 血清、血浆等样品如果在4℃保存，保存的时间不得超过2周，否则会影响检测结果的准确性。通常血清样品宜-20℃保存，-80℃保存更佳。
  
• 本制品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品。
  
• 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

• 样品的准备：
  
  • 血液样品的准备：对于血清样品，将全血在常温如25℃下放置30分钟～2小时，不要剧烈摇晃以免溶血，待全血自然凝固并析出血清后，4℃约1000～2000×g离心10分钟，取黄色上清即得血清，注意不要吸取白色或淡黄色沉淀；对于血浆样品，将全血用肝素或者EDTA进行抗凝，4℃约1000～2000×g离心10分钟，取黄色或淡黄色上清即得血浆，注意不要吸取白色沉淀。血清和血浆都需置于冰上，如果不能立即检测，也可以分装并短期保存于-20℃或-80℃。对于冻存的样品，在检测前解冻后冰浴存放备用，使用前必须混匀。
    
  • 细胞或组织样品的准备：对于培养的贴壁细胞，PBS洗涤一次并吸净残留液体。对于培养的悬浮细胞，先适当离心(如100～500×g，5分钟)收集细胞到离心管内，弃上清并吸净残留液体。按照每100万细胞加入100～200μL BalbLysis Buffer A for Metabolic Assay的比例加入裂解液，适当吹打，冰浴5～10分钟以充分裂解细胞。4℃约12000×g离心3～5分钟，取上清用于后续检测。对于组织样品，按照每10mg组织加入100μL BalbLysis Buffer A for Metabolic Assay的比例加入裂解，使用组织研磨仪、或玻璃匀浆器在约4℃或冰浴等低温条件下进行匀浆。4℃约12000×g离心3～5分钟，取上清用于后续检测。以上所有操作均需在4℃或冰上操作。制备好的细胞或组织样品如果不能立即检测，可以-20℃或-80℃冻存。
    
  • 细胞培养上清样品的准备：对于贴壁细胞，直接取培养液；对于悬浮细胞，离心取培养液。
• 试剂盒的准备：
  
  • 融解Glucose Assay Buffer，平衡至室温后混匀备用。Glucose Assay Reagent A和Glucose Assay Reagent B于融解后放置于冰浴备用，使用完毕后宜立即按照试剂盒要求的条件保存。
    
  • Glucose检测工作液(Working Solution)的配制：按照每个检测反应160μL的体积配制适量的Glucose检测工作液。均匀混合154μL Glucose Assay Buffer、4μL Glucose Assay Reagent A、1μL Glucose Assay Reagent B、1μL Enzyme Solution，即可配制成160μL Glucose检测工作液。根据待检测样品(包括标准品)的数量，配制适量的Glucose检测工作液。具体配制方法参考下表。配制好的Glucose检测工作液如果置于4℃或冰浴避光保存，可以在当天使用，但建议尽量现配现用。
    

    样品数量	1	10	20	50
    Glucose Assay Buffer(μL)	154	1540	3080	7700
    Glucose Assay Reagent A(μL)	4	40	80	200
    Glucose Assay Reagent B(μL)	1	10	20	50
    Enzyme Solution(μL)	1	10	20	50
    Working Solution(μL)	160	1600	3200	8000

    • 由于Glucose Assay Reagent A、Glucose Assay Reagent B和Enzyme Solution用量较少，必须注意在使用前轻轻离心一下，并适当混匀后再使用。
    • H2O2的存在会对葡萄糖的检测产生干扰。如果样品含有H2O2，须同时设置样品背景对照孔，加入不含Enzyme Solution的Glucose检测工作液，即配制Glucose检测工作液时1μL Enzyme Solution用Glucose Assay Buffer替代。计算时样品孔的读数需要减去样品背景对照孔的读数。
• 样品测定：
  
  • 葡萄糖标准曲线设置：取30μL Glucose Standard (4mg/mL)，加入270μL Glucose Assay Buffer，混匀，配制成浓度为0.4mg/mL的葡萄糖标准溶液。分别取0.4mg/mL的葡萄糖标准溶液0、1、2.5、5、10、20、30、40μL加入96孔板的标准品孔中，并相应地用Glucose Assay Buffer补足至40μL，此时，标准曲线的浓度分别为0、0.01、0.025、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4mg/mL。
    
    • 吸光度检测时推荐使用透明96孔板。
  • 取1～40μL样品或稀释后的样品至96孔板样品孔中，并相应地加入Glucose Assay Buffer至样品孔中，补足至40μL。同时设置仅含Glucose Assay Buffer的孔为空白对照。
    
    • 为确保样品数值在标准曲线范围内，建议进行预实验将样品设置多个稀释倍数，以确定样品中葡萄糖的大致浓度，如果数值不在标准曲线范围内，请调整样品的稀释倍数或者样品的量。样品总稀释倍数记为n (例如本步骤中对样品进行了10倍稀释，加入的“稀释后的样品”为20μL，则n=10×40/20=20)。
  • 每孔加入Glucose检测工作液160μL，混匀，40℃避光反应10分钟。
    
  • 反应结束后，请在A510nm进行吸光度检测。
    
  • 建立标准曲线，并计算样品中葡萄糖的浓度(A)葡萄糖标准曲线可以参考图2，吸光度检测在0.01～0.4mg/mL浓度范围内有良好的线性关系。葡萄糖浓度的计算公式如下：
    C (mg/mL)=A×n
    A为步骤3e根据标准曲线确定的葡萄糖含量(mg/ml)；
    n为步骤3b样品总稀释倍数。
    可根据葡萄糖的分子量180计算出样品中葡萄糖的摩尔浓度(mM)=C/0.18。